Cwiczenie 7
Wykorzystanie danych krystalograficznych i grafiki komputerowej do
analizy struktury makromolekul
W cwiczeniu analizujemy struktury bialek okreslone metodami krystalograficznymi i zdeponowane w banku danych bialkowych PDB (Protein Data Bank). Wykorzystujemy w tym celu technike komputerowa zwana kinemage, czyli technike obrazow kinetycznych (OK). Jest to narzedzie uzywane przez naukowcow wykorzystujace mozliwosci interakcyjnej grafiki komputerowej.
Aby uruchomic program należy przejsc do swojego katalogu a
nastepnie wpisac komende magic i chwile poczekac.
Na poczatek zapoznaj się
z czekajacymi na Ciebie zadaniami na koncu opisu tego cwiczenia.
Obraz kinetyczny 1:
Ruch centrum aktywnego karboksypeptydazy A
W okienku File-Open File mozesz wybrac kilka zestawow obrazow kinetycznych OK. Na poczatek wybierz demo2.2a.kin. W zestawie tym jest kilka OK. OK_1 pojawia sie automatycznie. Jest to animowana reprezentacja zmian konformacyjnych karboksypeptydazy A zachodzacych podczas wiazania substratu, ktorym jest dwupeptyd glicylotyrozyna (Gly-Tyr). Ilustracje wykorzystuja dane strukturalne (w obrebie centrum aktywnego) zdeponowane w PDB przez Christiansona i Lipscomba oraz przez Reesa i wsp.
Wiekszosc funkcji oferowanych przez OK. jest zrozumiala sama przez sie. Zapoznaj sie z nimi poslugujac sie mysza i wlasna wyobraznia. Na pierwszy plan ekranu mozesz wprowadzic okienko tekstowe, graficzne lub z krotkim komentarzem przez klikniecie mysza w odpowiednim obszarze. Wielkosc i polozenie okienek moga byc modyfikowane zgodnie z regulami systemu Windows. Okienka z tekstem moga byc "przewijane" (suwak!). Inny OK. z zestawu uzyskasz naciskajac przycisk Kinemage a nastepnie wybierajac Next lub podajac liczbe.
Ruchy myszy powoduja rotacje obrazu: przeciaganie kursora w poprzek gornej czesci ekranu graficznego powoduje obrot wokol osi Z (w plaszczyznie ekranu). Przeciaganie kursora w innych czesciach ekranu powoduje obroty wokol osi X, Y lub ich kombinacje. Glebie pola widzenia uzyskano zmieniajac intensywnosci barwy.
Aby wrocic do widoku poczatkowego, nacisnij Views i wybierz View1. Dany OK. moze byc przedstawiony nawet w 9 rzutach. Uzytkownik (toTy!) moze dobrac sobie najbardziej odpowiadajacy mu rzut, zapamietac go przy pomocy set reader's view z menu Views, a nastepnie wrocic do niego korzystajac z menu Views. Wyprobuj!
Aby uzyskac Animacje struktury karboksypeptydazy naciskaj raz za razem przycisk animate w okienku graficznym. Z pewnoscia zauwazyles ogromne zmiany polegajace na: (1) pojawieniu sie substratu (czerwony dwupeptyd Gly-Tyr) oraz (2) ruchu Tyr248 (kolor blekitny). Nie sa to jedyne zmiany strukturalne przy przejsciu enzymu z formy apo (wolnej) do holo (skompleksowanej); ruch, choc znacznie mniejszy, obserwuje sie rowniez w wielu innych fragmentach struktury. Przeprowadz jeszcze raz animacje zmian, ale przy innej orientacji.
Wyprobuj funkcje TURN ON i OFF (wylacznik) dla roznych grup naciskajac odpowiednie przyciski w okienku graficznym. Wlacz obie formy przez "zaznaczenie" 3cpa-GY oraz 5cpa-apo. Teraz wylacz Tyr248 w obu formach. Wylacz rowniez Gly-Tyr i lancuch glowny main chain i przeprowadz ponownie animacje obserwujac ruchy innych lancuchow bocznych. Powtorz animacje majac na ekranie jedynie lancuch glowny main ch i atom Zn, aby zaobserwowac subtelne zmiany w przebiegu lancucha glownego.
Grupa static obejmuje obiekty niezmienne podczas animacji: zolty krzyz oznaczajacy Zn oraz etykiety. Przelacz kilka razy grupe static oraz jej skladniki aby zrozumiec logike tych przyciskow: dany obiekt moze byc wlaczony zarowno przy pomocy swojego przycisku, jak i przycisku grupowego wyzszego ranga.
Wyprobuj funkcje Informacyjne. Wlacz znaczniki (markers). Pojawi sie punkt w centrum 0,0,0. Wybierz atom: jego polozenie zaznaczy jeden z dwoch markerow oraz pojawi sie komentarz dotyczacy wybranego atomu. Wybierz kolejny atom: w jego miejscu pojawi sie drugi znacznik, wyswietlony zostanie komentarz oraz odleglosc pomiedzy zaznaczonymi atomami. Komentarz i informacja o odleglosci funkcjonuja rowniez bez znacznikow, ale jest wowczas trudniej sledzic wybierane atomy. Mierzyc mozna odleglosci miedzy roznymi atomami lub miedzy tym samym atomem w roznych konformacjach.
Otworz menu Display. One width pozwala na przelaczanie pomiedzy linia o jednakowej grubosci a linia zwezajaca sie w glab. Thin line rysuje najciensza z mozliwych na danym ekranie lini. Perspective pomniejsza obiekt w miare wzrostu odleglosci od widza.
W okienku Tools znajdziesz stereo on, measures i drawline (objasnienia ponizej). Rowniez pod Tools znajduje sie opcja Kludges, ktore zawiera m.in. funkcje XYZ point (wyswietlanie wspolrzednych x,y,z wybranego ostatnio punktu oraz gnomon (znaczek reprezentujacy polozenie osi wspolrzednych).
Obraz kinetyczny 2:
Szkielet Calfa i centrum aktywne
anhydrazy weglanowej
OK_2 (wybierz Next w okienku Kinemage) pokazuje lancuch Calfa ludzkiej anhydrazy weglanowej II, zaznacza w centrum aktywnym jonu cynku (Zn) wraz z jego ligandami (kolor niebieski) oraz petle (kolor zielony), ktorej reszty badano stosujac wyczerpujaca mutageneze. Obroc rysunek by ukazac duzy, skrecony arkusz beta, wneke centrum aktywnego oraz polozenie petli.
Wyprobuj funkcje najazdu (Zoom) uzywajac suwaka w prawej czesci ekranu. Ustaw wspolczynnik najazdu na ok. 3 i wybierz opcje stereo z okienka Tools. Ekran zostanie podzielony na dwa obrazy: dla lewego i prawego oka. Sprobuj zobaczyc obraz trojwymiarowy.
Wybierz View2 i zaznacz mutant sc (lancuchy boczne mutantow). Na przemian, wylacz i zapal zolty lancuch wegli Calfa, aby ocenic, ktore fragmenty sa ukryte. Wyprobuj zmiany grubosci wyswietlanej warstwy (zslab). Uzyj rowniez funkcji stereo dla tego rejonu dobierajac zoom dla uzyskania najlepszego efektu. Dla kazdej reszty w petli otrzymano wiele mutantow poznajac w ten sposob role kazdego aminokwasu z tego fragmentu. Ich role mozna podzielic na piec kategorii przedstawionych za pomoca kolorow (Color-keyed) i opisanych etykietami. Reszty fioletowe sa istotne dla procesu zwijania lancucha: sa to glownie pierscienie aromatyczne w obszarze arkusza beta. Reszty zielone wplywaja na szybkosc uwadniania CO2, z zolte wplywaja na pKa. Obie grupy leza blisko centrum aktywnego (za wyjatkiem Glu205). Reszta czerwona odpowiada za trwalosc termiczna: jest to cis prolina przy koncu petli. Mutacje bialych aminokwasow nie wywolaly istotnych efektow.
Obraz kinetyczny 3:
Szczegolowa struktura mutowanej petli anhydrazy
weglanowej
Aby skupic sie na atomie Zn i otaczajacych go tetraedrycznie atomach N (wszystkie zaznaczone krzyzykami), wybierz opcje Pickcenter, kliknij kursorem w miejsce atomu Zn, a nastepnie wylacz przycisk Pickcenter. Pomocne moga byc najazdy i opcja stereo. Aby obejrzec petle, wyswietl jej etykiety i wybierz View1. Objasnienia jak wyzej.
Obraz kinetyczny 4:
Obszar kontaktowy w strukturze zawierajacej
helisy alfa z “zamkiem leucynowym”
OK_4 pokazuje dimer helisy alfa zawierajacy zamek leucynowy. Oba lancuchy maja identyczne sekwencje i jednakowa orientacje, z koncami aminowymi w kierunku widza. Obszar pokazuje tylko atomy Calfa oraz lancuchy boczne w obszarze styku. Ustaw glebie pola widzenia (zslab) na 400. Zwoj superhelikalny (supercoiling) umozliwia dwom helisom zachowanie jednakowego odstepu na calej dlugosci choc w wiekszosci par helis znalezionych w bialkach globularnych sytuacja jest inna: helisy sa prostsze i rozchodza sie na koncach. Tutaj kontakty miedzyhelikalne utworzone sa poprzez zespoly reszt, ktore wygladaja jak szczeble drabiny. Wybierz View2 aby zobaczyc “drabine” z boku. Co druga poprzeczka utworzona jest przez pare leucyn (pomaranczowe); pomiedzy nimi sa szczeble zlozone z (zoltych) walin (wyjatkiem jest Met2 oraz rozowa Asn16 w poblizu srodka).
Najlepsza “podroz” po obszarze kontaktowym zapewnia View3. Przesun suwak ztrans maksymalnie do gory. Pokaze sie fragmencik lancucha glownego i lancuchy boczne Met2 na poczatku obu helis. Teraz ustaw kursor myszy na dole zakresu ztrans aby przesuwac strukture przez waski zakres pola widzenia. Za kazdym nacisnieciem myszy zobaczysz kolejna poprzeczke zamka. Zauwaz podobienstwo wszystkich szczebli zbudowanych z Leu (pomaranczowe). Poprzeczki walinowe (zolte i rozowe) sa rowniez podobne, choc w szczegolach rozne od poprzeczek leucynowych.
Najlepszy widok zamka uzyskasz wybierajac View4 wylaczajac heptad sc i wlaczajac zipper sc. Glowne kontakty w ramach jednego szczebla (czy poziomu) maja charakter “bok do boku”. Mozna jednak doszukac sie dwoch dalszych, pionowych zamkow z grup bocznych (zielony z przodu, czerwony z tylu). W kazdym z nich pasmo leucyn z jednej helisy przeplata sie z pasmem walin z drugiej. Wlacz tylko zestaw zielony (front zip) lub tylko czerwony (rear zip). View5 daje widok boczny obu tych zamkow.
Obraz kinetyczny 5:
Helisa alfa
OK_5 przedstawia daszek asparaginowy na aminowym koncu helisy alfa (reszte, ktora tylko w polowie nalezy do zwoju helikalnego). Lancuch boczny tej asparaginy “udaje” konformacje i oddzialywania jeszcze jednej reszty w lancuchu glownym na poczatku helisy. Wybierz mysza atom OD1 Asn280 (czerwony znaczek na zoltym lancuchu bocznym), a nastepnie atom N tuz pod nim (znaczek niebieski). Otrzymasz informacje: N Gln 283 i odleglosc 2.7 A.
Wlacz funkcje measure z menu Tools. Poczawszy od Asn, wybieraj kolejno atomy Calfa, C karbonylowy, N ... wzdluz lancucha glownego obserwujac jednoczesnie wyswietlane informacje. W miejscu dihedral angle (=kat dwuscienny, czyli torsyjny) bedzie wartosc 0.0 dopoki nie wybierzesz 4 atomow, a potem zaczna pojawiac sie kolejno wartosci katow torsyjnych omega (ok.180° ), phi (okolo –60° w helisie alfa ), psi (okolo –40° w helisie alfa ), omega, phi , psi. Wylacz i wlacz przycisk measure aby wyczyscic zapis a nastepnie zaznaczyc atomy asparaginy: N, Calfa , Cbeta , Cgama aby zmierzyc jej kat chi1 w lancuchu bocznym (okolo +60° ).
Pytania: