Cwiczenie 3
Baza danych krystalizacyjnych BMCD, krystalizacja bialek
Zadanie 1.
W zestawie krystalizacyjnym Crystal Screen firmy Hampton Researchhttp://www.hamptonresearch.com/
(szukaj w Products, Crystallization Screens, Crystal Screen i wlacz pdf "crystal screen formulation")
wyszukaj warunki, w ktorych czynnikiem stracajacym (ang.: precipitant) jest siarczan amonu (gr.1), glikol polietylenowy PEG (gr. 2), 2-metylo-2,4-pentanodiol MPD (gr. 3), izopropanol (gr. 4), cytrynian sodu (gr. 5). Jakie sa stezenia czynnika stracajacego? Jakiego typu zwiazkami chemicznymi sa czynniki wytracajace bialko? Jakie sa ekstremalne wartosci pH testowane tym zestawem?
Zadanie 2
. Ze strony www CBB lub bezposrednio:http://wwwbmcd.nist.gov:8080/bmcd/bmcd.html
polacz sie z baza danych o krystalizacji biomolekul (w NIST National Institute of Standards and Technology w USA) – BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database). Znajdz w niej informacje o krystalizacji lizozymu z jaja gesiego (ang. lysozyme, anser, egg white). Wybierz w tym celu opcje Macromolecules.
Zanotuj warunki krystalizacji oraz odnosnik literaturowy do publikacji, w ktorej po raz pierwszy opisano te krystalizacje. Czy warunki te przypominaja jakis zestaw z kompletu Screen 1 lub Screen 2? Co jest czynnikiem stracajacym? Jaki zastosowano bufor? Jakie bylo pH roztworu krystalizacyjnego? W jakiej temperaturze prowadzono krystalizacje? Jakie bylo stezenie bialka? Jak dlugo rosly krysztaly? Jaka metode krystalizacji zastosowano w tym przypadku?
Zadanie 3
. Przeanalizuj symetrie otrzymanych przez autorow krysztalow:Czy w bazie BMCD mozna znalezc warunki krystalizacji lizozymu z innych organizmow? Jesli tak to z jakich (wymien kilka przykladow)? Sprawdz czy warunki krystalizacji lizozymu gesiego przypominaja te opracowane dla lizozymu z podobnych organizmow
Zadanie 4.
Pokaz krystalizacji lizozymu. Sprzet: plytka krystalizacyjna, silikonizowane szkielka nakrywkowe, smar silikonowy do uszczelniania, pipety automatyczne, tipsy. Odczynniki: bialko (lizozym) o stezeniu 20 mg/ml, odpowiedni roztwor buforowy, roztwor soli, odczynnik stracajacy, woda. Krystalizacja bedzie przeprowadzana metoda kropli wiszacej w temperaturze 20° C.
Rys.1
Schemat metody kropli wiszacej: 1 silikonizowane szkielko nakrywkowe, 2 roztwor bialka, 3 zbiornik, 4 roztwor czynnika stracajacego, 5 smar silikonowy.Wlasciwosci krysztalow makromolekularnych
- 30 – 80 % - rozpuszczalnik (“uporzadkowany zel”)
- niewielka liczba bezposrednich oddzialywan miedzy czasteczkami bialka
- obszary i kanaly wodne gwarantuja natywna konformacje bialka, latwa penetracje mniejszych czasteczek
- trwalosc w niewielkim zakresie: pH, temperatury, sily jonowej. Roztwor macierzysty zawsze konieczny
- ograniczony stopien porzadku w sieci
- ograniczony zakres dyfrakcji
- promienie X inicjuja rozklad
Montowanie krysztalu w kapilarze
Krysztaly bialek otrzymane w naszym laboratorium
1. Forma regularna Ludzkiej Cystatyny C (HCC)
2. Se-Met pochodna HCC
3. Tetragonalna forma cietej HCC
4. BPTI
5. Mutant S58A L-Asparaginazy
6. Mutant N248E L-Asparaginazy
