Połącz się z bazą danych BMCD. Aby to zrobić cofnij się używając przycisku Wstecz (lub Back) do tekstu ćwiczenia i wybierz poniższy adres:

http://wwwbmcd.nist.gov:8080/bmcd/bmcd.html

Połączyłeś się z bazą danych o krystalizacji biomolekuł BMCD (Biological Macromolecule Crystallization Database) w NIST (National Institute of Standards and Technology) w USA. W bazie tej przechowywane są informacje o warunkach krystalizacji makrocząsteczek biologicznych. Krystalizacja jest pierwszym i trudnym etapem w pracy krystalografa. Od jego powodzenia zależy sukces całego procesu określania struktury białka. Jeśli białko nie tworzy kryształów, niemożliwe jest określenie jego struktury metodami rentgenowskimi. Dlatego tak ważne jest gromadzenie informacji o warunkach krystalizacji białek. Często podobne białka (np. mutanty) mogą być krystalizowane w bardzo podobnych warunkach.

W polu wyszukiwarki wpisz symbol grupy przestrzennej wyszukanego w PDB "Twojego" bialka. Ukazuje się nowa strona WWW, a na niej wypisane alfabetycznie białka krystalizujące w tej grupie. Korzystając z tego, ze znasz nazwę swojego białka znajdź je na tej stronie i wybierz. Na nowej stronie znajdziesz krotki opis białka i jego właściwości oraz informacje o warunkach krystalizacji. Następnie wynotuj:

?stężenie białka 

?skład roztworu rezerwuarowego 

?skład roztworu białka

?czas wzrostu kryształu

Teraz zajmiesz się badaniem pewnych właściwości strukturalnych kompleksu białka (w tym przypadku białka regulatorowego Cro) z krótkim fragmentem DNA. Celem ćwiczenia jest odpowiedź na pytanie, jaki rodzaj oddziaływań odpowiedzialny jest za łączenie się białka Cro z cząsteczkami DNA. Aby odpowiedzieć na to pytanie wykonaj poniższe polecenia.

Jedno okno przeglądarki służyć Ci będzie do czytania poleceń, w drugim połączysz się ze stroną zawierającą strukturę. Struktura zdeponowana jest w banku PDB z kodem 3CRO. Wyswietl te strukture za pomoca programu RasMol. Przed tobą powinna pojawić się struktura kompleksu białka Cro z fragmentem DNA. Struktura ta pojawiła się w postaci Wireframe (patrz - słowniczek na końcu ćwiczenia), czyli modelu drutowego - poszczególne punkty odpowiadające atomom niewodorowym w strukturze połączone są patyczkami. Używając myszy i klawiatury możesz pomniejszać lub powiększać obraz, obracać go w zadany sposób itp. Przyciśnij lewy klawisz myszy i obracaj strukturę w okienku. Aby zmniejszyć lub powiększyć obraz naciskaj klawisz Shift i jednoczesnie poruszaj mysza naciskając jej lewy przycisk. Prawy przycisk myszy i klawisz Ctrl umozliwiaja przesuwanie obrazu w plaszczyznie ekranu. Prawy przycisk i Shift powoduje obrot wokol osi prostopadlej do ekranu. Aby zmienić wygląd obrazka wybierz z górnej listwy polecenie Display i sprawdzaj kolejne opcje. Jesli uzywana wersja programu RasMol nie posiada listwy opcji, mozesz je wyswietlic naciskajac prawy klawisz myszy. Sprobuj eksperymentowac z kolorami używając opcji Colours. Gdy już zapoznasz się z podstawowymi możliwościami graficznymi programu wykonaj następujące zadania:

?jakie dwa typy makrocząsteczek wyświetliłeś? Aby lepiej obserwować DNA, naciśnij w oknie zawierającym cząsteczkę prawy klawisz myszy, z ukazującego się menu wybierz polecenie Select a następnie polecenie Nucleic i raz jeszcze Nucleic. Potem naciśnij prawy klawisz myszy i wybierz sekwencje poleceń: Select, Hide, Hide not Selected. Raz jeszcze naciśnij prawy klawisz myszy i wybierz polecenie Display, a następnie Ball & Stick. 

?Jaką skrętność ma podwójna helisa DNA? Aby zobaczyć jak poszczególne zasady łączą się ze sobą, przyciskając prawy klawisz myszy wykonaj następujące polecenia:

oselect następnie nucleic a potem purine

oselect a potem change color to następnie green

oselect następnie nucleic a potem pyrimidyne

oselecta potem change color to następnie purple

Jakie zasady łącza się w pary? Możesz to sprawdzić wykonując:

oselect następnie nucleic a potem AT

oselect a potem change color to następnie white

oselect następnie nucleic a potem CG

oselect a potem change color to następnie red

Aby przedstawić pełną strukturę DNA wykonaj następujące polecenia:

oselect następnie nucleic a potem backbone

oselect a potem change color to następnie Orange

Pokolorowałeś w ten sposób szkielet fosforanowo-cukrowy na pomarańczowo, natomiast zasady pozostały bez zmian. Jaki rodzaj ugrupowań chemicznych wchodzących w skład helisy znajduje się na zewnątrz łańcucha DNA? Aby lepiej to obserwować wykonaj następujące polecenia:

Select a następnie polecenie Nucleic i raz jeszcze Nucleic. Potem naciśnij prawy klawisz myszy i wybierz sekwencje poleceń: Select, Hide, Hide not Selected. Raz jeszcze naciśnij prawy klawisz myszy i wybierz polecenie Display, a następnie Spacefill, Van der Waals Radii.

Jakie elementy struktury DNA wyściełają bruzdę większą a jakie mniejszą?

Aby lepiej zilustrować połączenia między zasadami używając opcji Display zmień sposób przedstawienia DNA na Wireframe, powiększ nieco obraz i wybierz polecenie Options a następnie Display Hydrogen Bonds. Wybierz również Select, Click Mouse Action i Distance.

Ile para zasad przypada na pełen zwój podwójnej helisy? Jaka formę (A, B, Z?) ma podwójna helisa DNA w analizowanej strukturze?

Ile wiązań wodorowych łączy zasady w parach A-T, a ile w parach C-G?

Określ atomy donorów i akceptorów oraz długości tych wiązań wodorowych (Donor .... Akceptor)? (Długość wiązania między dwoma atomami będzie się pojawiała na dolnej listwie przeglądarki, gdy wybierzesz prawym klawiszem myszy każdy z nich). Aby ułatwić sobie wykonanie ostatniego polecenia wybierz z menu Display opcję Ball & Stick.

Wyłącz opcję Display Hydrogen Bonds (menu Options)

Wykonaj sekwencję poleceń: Select, Protein, Protein

Następnie Select, Hide, Hide not Selected (wszystko zniknie), a potem

Wybierz opcję Display, Backbone

Jakie elementy struktury drugorzędowej potrafisz odnaleźć w strukturze tego białka?

Jakie motywy struktury naddrugorzędowej zauważyłeś?

Jaka jest struktura czwartorzędowa tego białka?

Powiększ nieco dowolny fragment białka. Z menu Display wybierz opcje Ball & Stick. Sprawdź długości następujących wiązań:

- peptydowego

- C_alfa - C

- N-C_alfa

- C-O

- wiązania wodorowego w helisie, w pętli, miedzy łańcuchami bocznymi aminokwasów

Aby zaznaczyć wiązania wodorowe wybierz sekwencje poleceń: Options, Display Hydrogen Bonds. Zapisz długości poszczególnych wiązań. W jakim zakresie odległości mieszczą się długości wiązań wodorowych, które wybrałeś do pomiaru?

Najpierw pomniejsz cząsteczkę białka

1.Select, Select All

2.Color, Monochrome

3.Display, Wireframe

4.Options, Display Hydrogen Bonds (włącz je)

Jakie łańcuchy boczne białka najczęściej penetrują bruzdy podwójnej helisy DNA?
Jakie oddziaływania z cząsteczką (anionem) DNA są w ich przypadku najbardziej prawdopodobne?
Czy są jakieś wiązania wodorowe pomiędzy białkiem a DNA?

Wykonaj następujące polecenia:

1.Select, Hetero, Hetero

2.Display, Ball & Stick

Zaznaczyłeś w ten sposób cząsteczki wody obecne w strukturze kompleksu Cro-DNA. Czy są jakieś cząsteczki wody pomiędzy białkiem a DNA? Zmierz odległości pomiędzy cząsteczkami wody a atomami DNA lub białka.

Aby lepiej zilustrować charakter oddziaływań białko-DNA wykonaj:

1.Select, Protein, Protein

2.Display, Cartoons

3.Select, Change Color To, Red

4.Select, Nucleic, Nucleic

5.Display, Spacefill, van der Waals Radii

6.Select, Change Color To, White

Powiększ rysunek i analizuj jego fragmenty. Widzisz teraz na jakiej zasadzie białko wiąże się z DNA. Wnioski wpisz do zbioru z wynikami.

backbone - przedstawia makrocząsteczkę w formie połączonych ze sobą atomów C_alfa

Ball & Stick - przedstawia makrocząsteczkę w formie modelu kulkowo-patyczkowego (atomy reprezentowane są przez kulki, wiązania miedzy nimi przez patyczki)

Sticks - model szkieletowy; przedstawiony za pomoca wiazan

select - umożliwia wybranie pewnej części cząsteczki (pozostałe są widoczne)

spacefill - przedstawia makrocząsteczkę w formie modelu czaszowego (zwanego tez CPK od nazwisk Corey-Pauling-Koltun), w którym atomy przedstawione są za pomocą swych sfer van der Waalsa w kolorach C=szary, N=niebieski, O=czerwony, S=zolty.

wireframe - przedstawia makrocząsteczkę w formie modelu drutowego, w którym widoczne są wiązania pomiędzy punktami odpowiadającymi poszczególnym atomom.